胃癌也分“冷熱”？ARID1A突變的HER2陰性胃癌免疫治療或更有效！

本研究旨在分析前瞻性試驗中HER2陽性和陰性患者可能影響腫瘤進展和治療反應的基因特徵。從參加TROX-A1試驗（UMIN000036865）的胃癌患者中收集了80份福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本（49例HER2+，31例HER2-）。使用435基因panel（CANCERPLEX-JP）獲得全面的基因組分析資料，包括腫瘤突變負荷，體細胞突變和複製數變異。分析HER2+和HER2-胃癌患者的基因特徵差異。突變分析表明，TP53是突變頻率最高的基因，無論HER2狀態如何。ARID1A突變在HER2陰性患者中顯著富集。具有ARID1A突變的HER2陰性患者的總突變數目顯著高於HER2陽性患者。複製數變異分析表明，HER2陽性患者基因擴增（如CCNE1、PGAP3和CDK12）數目顯著高於HER2陰性患者。PTEN缺失在HER2陽性患者中更為常見。與HER2陽性患者相比，HER2陰性患者往往具有更高的腫瘤突變負荷，特別是ARID1A突變患者。基因變異通路分析顯示，HER2陰性患者中幾條免疫相關通路富集。根據HER2陽性和陰性胃癌的基因組分析，HER2通路的幾種基因變異可能是曲妥珠單抗耐藥的潛在機制。與HER2陽性胃癌相比，具有ARID1A突變的HER2陰性胃癌可能對免疫檢查點抑制劑敏感。

研究背景

胃癌是一種常見的惡性，也是全球癌症相關死亡的主要原因之一。轉移性胃癌患者靶向治療選擇有限，預後不良。近年來，關注基因變異的精準醫療改善了實體瘤（包括胃癌）患者的預後。在胃癌中，已經開發出靶向療法，對人表皮生長因子受體2（HER2）陽性，微衛星高度不穩定（MSI-H），神經營養酪氨酸受體激酶（NTRK）基因融合的患者有效。最近，3期臨床試驗SPOTLIGHT顯示，抗claudin 18.2抗體Zolbetuximab改善了claudin 18.2陽性HER2陰性胃癌患者的無進展生存期（PFS）和總生存期（OS）（NCT03504397）。此外，有臨床研究正在評估成纖維細胞生長因子受體（FGFR）抑制劑在胃癌中的療效（TAS-120：NCT04189445；FORTUNE Trial：NCT04962867）。這些發現可能有助於在未來提供新的標準療法。隨著用於基因組分析的下一代測序（NGS）方法的興起，有關靶向治療的研發方法和臨床實踐都發生了巨大變化。

由ERBB2基因編碼的HER2在約15%的胃癌患者中過表達/擴增。ERBB2是癌基因，透過啟用PI3K/Akt通路驅動腫瘤進展。因此，靶向HER2是治療HER2過表達胃癌的一種有吸引力的策略。2010年，ToGA試驗表明，曲妥珠單抗（抗HER2抗體）聯合化療為HER2陽性胃癌患者帶來生存獲益。曲妥珠單抗組的中位OS為13.8個月，而僅化療組為11.1個月（風險比（HR）= 0.74；95%置信區間（CI）= 0.60–0.91；p = 0.0046）。這些結果確立了曲妥珠單抗聯合化療作為HER2陽性胃癌患者的一線治療。然而，一些HER2陽性胃癌並未獲益於曲妥珠單抗治療。先前的幾項研究提供了免疫組化（IHC）資料，表明磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）低表達是胃癌曲妥珠單抗耐藥的原因。為了進一步闡明抗HER2治療耐藥機制，使用NGS對HER2陽性胃癌進行全面的基因組分析可能是一種有效的方法。

我們之前透過全面的基因組分析識別了參與胃癌進展的幾個新的驅動基因。在本研究中，我們使用NGS大panel評估了80例參加TROX-A1試驗（UMIN000036865）的胃癌患者的基因圖譜。比較了49例HER2陽性和31例HER2陰性胃癌患者的基因圖譜，探索了胃癌患者基因特徵差異對腫瘤進展和治療反應的潛在影響，包括抗HER2治療耐藥機制。

研究結果

80例胃癌患者組織樣本NGS基因檢測結果

納入了49例HER2陽性和31例HER2陰性胃癌患者（TROX-A1試驗，圖1）。使用CANCERPLEX-JP獲得了80例胃癌患者的基因圖譜。在49例HER2陽性胃癌患者中發現了98個非同義突變、107個擴增和114個缺失。在31 例HER2陰性胃癌患者中發現了74個非同義突變、31個擴增和61個缺失。分別分析HER2陽性和HER2陰性患者的基因圖譜（圖2A，B）。如圖2所示，在HER2陽性胃癌患者中，體細胞突變發生率最高的基因是TP53（78%）、APC（14%）和RHOA（12%），最常見的CNV是的ERBB2擴增（63%），CDK12擴增（39%）和PGAP3擴增（39%）。在HER2陰性患者中，TP53突變（65%）、ARID1A突變（32%）、RHOA突變（23%）、STK11缺失（29%）、AMER1缺失（19%）和TSC2缺失（16%）是最常見的基因變異。

圖1. TROX-A1試驗研究流程（n=80）

圖2. HER2陽性和HER2陰性患者的基因圖譜

HER2陽性和HER2陰性胃癌非同義突變比較

接下來，比較了HER2陽性和HER2陰性胃癌患者的非同義突變。HER2陽性和HER2陰性患者的非同義突變數目沒有顯著差異（圖3A）。然而，具有ARID1A突變的HER2陰性患者的總突變數目顯著高於HER2陽性患者（圖3A，Mann-Whitney U檢驗p = 0.003）。具有ARID1A突變的HER2陰性腫瘤和具有ARID1A突變的HER2陽性腫瘤的中位非同義突變數目分別為4和5.5。火山圖展示了基於HER2狀態的非同義突變的富集（圖3B）。ARID1A突變在HER2陰性患者中顯著富集（Fisher精確檢驗p <0.001）。KRAS，RHOA，SMAD4，FBXW7，SMO，ATM，MAP2K1，JUN，PTPRT，SMARCA4，TET2，FANCC，CCND2，PALB2，BRCA1，SMAD2和PI3KCA突變在HER2陰性患者中富集，儘管不顯著。RNF43，APC，PTEN，POLE和TGFBR2突變在HER2陽性患者中富集。

圖3. HER2陽性和HER2陰性胃癌非同義突變差異

HER2陽性和HER2陰性胃癌CNV比較

然後，比較HER2陽性和HER2陰性胃癌患者的CNV。HER2陽性患者的基因擴增數目明顯高於HER2陰性患者（圖4A，Mann-Whitney U檢驗p = 0.001）。HER2陽性和HER2陰性患者的基因缺失數目沒有顯著差異（圖4B）。ERBB2，CDK12和PGAP3擴增在HER2陽性患者中顯著富集（圖4C，Fisher精確檢驗p<0.01）。TOP2A，CCNE1，MYC，MET和EGFR擴增，以及PTEN，AXIN1，CDKN2A，CDKN2B，MEN1和TP53缺失在HER2陽性患者中富集，儘管不顯著（圖4C，D）。在HER2陰性患者中，富集的CNV包括PRKCI，ZNF217，KRAS，PIK3CA，CDK6，GNAS，FGFR2，MYCL，FLT1，KLF5，SRC，BRCA1，MDM2和FLT1擴增，以及TSC1，CDKN1A，TGFBR2，APC，SMAD2和CDKN1B缺失（圖4C，D）。

圖4. HER2陽性和HER2陰性胃癌CNV差異

通路分析

根據富集的基因變異，進行通路分析，探索HER2陽性和陰性胃癌患者腫瘤進展機制。使用DAVID評估KEGG通路富集。在HER2陽性和陰性患者中均顯著富集的通路定義為共同通路，僅在HER2陽性或陰性患者中顯著富集的通路定義為獨有通路。如圖5所示，識別了14條共同通路，其中大多數對腫瘤發生和進展很重要。只有1條通路，癌症轉錄失調，是HER2陽性患者獨有通路。識別了17條HER2陰性患者獨有通路，包括幾條免疫相關通路。

圖5. HER2陽性和HER2陰性胃癌富集基因變異的通路分析

HER2陽性與HER2陰性胃癌TMB比較

分析HER2陽性和HER2陰性胃癌患者的TMB差異。HER2陽性患者，HER2陰性患者和具有ARID1A突變的HER2陰性患者的中位TMB值分別為14.6，16.2和17.7 muts/Mb（圖6A，Mann-Whitney U試驗，HER2陽性vs HER2陰性p = 0.15，HER2陽性vs具有ARID1A突變的HER2陰性p = 0.22）。具有ARID1A突變的HER2陽性患者的中位TMB值為16.2。在HER2陰性胃癌患者中，特別是在ARID1A突變患者中，TMB有更高的趨勢，儘管差異沒有統計學意義。

圖6. HER2狀態與區域性免疫環境因素的相關性

胃癌區域性免疫環境與ERBB2擴增的相關性

另外，評估了TCGA資料庫胃癌患者ERBB2擴增與區域性免疫環境因素的相關性。區域性免疫環境因素包括非同義突變數目，CD8A mRNA表達水平和CYT評分（抗腫瘤免疫的定量方法）。ERBB2未擴增患者（n = 323）的非同義突變總數顯著高於ERBB2擴增患者（n = 70；圖6B，t檢驗p < 0.001）。此外，ERBB2未擴增患者（n = 338）的CD8A mRNA表達水平（CD8+ T細胞的標誌物）和CYT評分均顯著高於ERBB2擴增患者（n = 75；圖6C，D，t檢驗p < 0.001）。

HER2/ERBB2的一致性

最後，評估了臨床醫生使用傳統方法確定的HER2狀態與CANCERPLEX-JP panel檢測的ERBB2擴增的一致性。HER2陽性定義為IHC評分為3或IHC評分為2且FISH HER2/CEP17評分≥2。在總體人群中，HER2/ERBB2的一致性為73.8%（59/80）。在HER2陽性患者中，HER2/ERBB2陽性一致性為63.3%（31/49），在HER2陰性患者中，HER2/ERBB2陰性一致性為90.3%（28/31）。此外，在IHC評分為3的患者中，HER2/ERBB2陽性一致性為67.6%（25/37）。在IHC評分為2且FISH HER2/CEP17評分≥2的患者中，HER2/ERBB2 陽性一致性為50%（6/12）。IHC評分為3的患者HER2/ERBB2陽性一致性高於IHC評分為2且FISH HER2/CEP17評分≥2的患者。

幾項研究描述了HER2陽性和HER2陰性胃癌患者基因特徵的差異，提示這些患者曲妥珠單抗耐藥的潛在機制。然而，大多數是小規模回顧性研究，HER2陽性和陰性胃癌基因特徵差異如何潛在影響腫瘤進展尚不清楚。本研究使用CANCERPLEX-JP 435基因panel，分析了參加了前瞻性II期試驗的49例HER2陽性和31例HER2陰性胃癌患者的基因圖譜。具體而言，我們識別了HER2陽性和HER2陰性患者富集的基因變異和通路，探索了基因特徵差異對腫瘤進展和治療反應的潛在影響（圖7）。

圖7. HER2陽性和HER2陰性胃癌基因特徵總結

在HER2陽性胃癌中，首先關注兩種富集的基因變異：PTEN突變和PTEN缺失。PTEN突變為移碼突變p.T319fs以及新型核苷酸缺失p.Q245_P248del，在2例患者中觀察到。兩者都可能導致PTEN功能缺失，PI3K/Akt通路啟用。此外，在9例患者中觀察到PTEN缺失。PTEN缺失導致PTEN基因表達水平低。大量研究表明，PTEN陰性腫瘤，包括乳腺癌和胃癌，對曲妥珠單抗無反應。因此，觀察到的PTEN突變和缺失可能是HER2陽性胃癌曲妥珠單抗耐藥的潛在機制。

本研究發現，HER2陽性患者的基因擴增數目顯著高於HER2陰性患者，提示基因擴增可能與抗HER2治療的獲得性耐藥有關。我們關注HER2陽性患者中富集的CDK12、MET和EGFR擴增。ERBB2和CDK12都位於染色體17q12，是胃癌中高度擴增的區域。與之前的幾項研究一致，本研究中，39%的HER2陽性患者同時攜帶ERBB2和CDK12擴增，如圖2A所示。有趣的是，最近的體外實驗表明，在乳腺癌中，CDK12驅動曲妥珠單抗耐藥，CDK12抑制劑透過PI3K/Akt和Wnt通路增強對抗HER2治療的敏感性。因此，在胃癌中，CDK12和ERBB2共擴增可能是曲妥珠單抗耐藥的潛在機制。此外，已知乳腺癌中癌基因MET和EGFR可啟用PI3K/ Akt通路，因此曲妥珠單抗不能完全減輕這種訊號傳導。胃癌中這些基因擴增也可能影響對抗HER2治療的反應。

在HER2陰性患者中，我們關注ARID1A突變，這是繼TP53突變之後最富集和第二常見的突變。與之前的研究一致，本研究中，大多數ARID1A突變都是失活突變，可導致ARID1A表達缺失。有趣的是，ARID1A與錯配修復蛋白MSH2相互作用，ARID1A缺陷可能會增加多種人類癌症型別的突變負荷。此外，ARID1A缺陷型卵巢癌小鼠模型顯示突變負荷增加，腫瘤浸潤淋巴細胞數目增加，PD-L1表達水平更高。這些資料表明具有ARID1A突變的HER2陰性腫瘤可能是一種“熱腫瘤”，鼓勵我們進一步探索胃癌中區域性免疫環境與HER2狀態的相關性。儘管在HER2陽性患者中僅發現2例患者存在ARID1A突變（2/49），具有ARID1A突變的HER2陽性腫瘤與具有ARID1A突變的HER2陰性腫瘤在突變數目和TMB方面沒有明顯差異。因此，具有ARID1A突變的HER2陽性腫瘤的免疫原性可能與具有ARID1A突變的HER2陰性腫瘤相似。

通路分析顯示，幾條免疫相關通路與HER2陰性胃癌顯著相關，包括PD-L1表達和PD-1免疫檢查點通路。此外，與HER2陽性患者相比，HER2陰性患者靶向NGS panel計算的TMB值往往更高，特別是ARID1A突變患者。另外，TCGA全外顯子組測序資料集分析表明，ERBB2非擴增胃癌患者具有更高的突變數目、CD8A表達水平和CYT評分。所有這些發現都支援我們的假設，即HER2陰性胃癌是一種相對“熱腫瘤”，而HER2陽性胃癌是一種相對“冷腫瘤”。根據我們的假設，HER2陽性胃癌患者可能無法從免疫檢查點抑制劑中獲益。然而，研究表明，曲妥珠單抗可透過抗體依賴性細胞毒性（ADCC）和抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）啟用先天性和適應性免疫應答。這被認為是HER2陽性胃癌患者對曲妥珠單抗和免疫檢查點抑制劑聯合治療反應更好的原因。

在本研究中，HER2狀態和ERBB2擴增的一致性為73.8%，與之前幾項研究報告的一致性相似。腫瘤內異質性可能導致HER2狀態和ERBB2擴增的差異。本研究有兩個侷限。首先，臨床資料只有在TROX試驗的臨床分析完成後才能獲得。其次，沒有進行體內或體外實驗來進一步支援我們的假設。未來應透過結合臨床和實驗資料的基因組分析來驗證本研究結果。

已知飲酒是胃癌的危險因素。胃ADH（乙醇脫氫酶）負責人胃細胞中大部分乙醇代謝，形成對口服酒精的代謝屏障。因此，胃ADH可能參與致癌作用，確定ADH在胃癌中的作用將是有趣的。然而，本研究使用的panel未包括ADH。未來應探索胃ADH與HER2狀態的相關性。

總之，本研究表明了前瞻性試驗中HER2陽性和HER2陰性胃癌患者基因特徵的差異。HER2通路的幾種基因變異可能是曲妥珠單抗耐藥的潛在機制。此外，與HER2陽性胃癌相比，具有ARID1A突變的HER2陰性胃癌可能是對免疫檢查點抑制劑有反應的熱腫瘤。

參考文獻：

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